Gels 2D.
Protocoles.
Liens vers la masse.
Moteurs de recherche d'empreinte
peptidique.
Ateliers de formation.
Gels
2D...
Protocoles...
Les protocoles que nous utilisons en E2D (disponibles ici) sont basés pour la plupart sur:
-le livret "2D-Electrophoresis: principles and methods" par Berkelman and Stenstedt. Datant de 1998, il a heureusement été mis à jour récemment. Il comporte depuis quelques précisions et options récentes concernant la préparation de l'échantillon ainsi que son mode d'application sur les gels de 1ère dimension. Attention, vérifiez que vous avez la nouvelle version de Mai 2002, corrigée de 2 erreurs, elle est à nouveau disponible (1800ko).
-Les contributions orale et
écrite
de Rabilloud
& Santoni à l'Atelier INSERM 115 de Mai 2000 dont les
textes intégraux sont disponibles depuis peu sur la base
de données de l'INSERM (fabuleuse
idée, bravo
l'INSERM!!!), toutefois si le site pouvait gagner en confort de
lisibilité et de navigation, ce serait vraiment un plus.
-Pour des questions plus approfondies un ouvrage moins accessible mais bien plus complet traitant des techniques de préparation de l'échantillon, de la séparation en gels bidimensionnels et de l'identification des protéines est disponible chez Springer Verlag (Proteome Research: 2DGE and identification and detection methods, ed. Rabilloud, T. Springer, New York).
Les techniques utilisées pour les colorations
des gels sont celles très classiques du bleu de Coomassie ou de
l'argent dont un protocole, compatible avec la masse et très
rapide, est décrit par Corthals avec possibilité de
décoloration. Attention, rapidité=manque de
reproductibilité... mais le nitrate d'argent ne fournit jamais
une
coloration homogène de toutes façons, ce qui n'en fait
pas
un outil de choix pour des quantifications précises ou pour de
la protéomique différentielle. Pour cela,
préférez le marquage par radionucléides ([35]S
méthionine/cystéine) très sensible, mais qui
surestime les protéines riches en ces acides aminés et/ou
à haut "turn-over". Spandidos et Rabbitts (JMB 2002 318 21-31) font état d'une
technique intéressante combinant le marquage
métabolique et la coloration à l'argent afin de
séparer, dans le même gel, deux échantillons
différents... Les biais de chacune des deux techniques sont
compensés en inversant les marquages. De quoi faire de la
différentielle de haute voltige à moindre coût...
par rapport aux techniques basées sur l'emploi
d'onéreuses cyanines détectables sur des scanner à
lasers!
Toutefois ces dernières techniques, pour les avoir employées récemment, font vraiment leur preuve. Avec très peu de matériel biologique, il est possible de diviser le nombre de gels bidimensionnels par 2 et d'éliminer les phases laborieuses et chronophages d'alignement et de matching des gels. D'autre part le gain de sensibilité apporté par la fluorescence permet, si un scanner a fluorescence est accessible, d'obtenir une quantification sur 4 logs (5 sur le papier, mais en réalité les photomultiplicateurs ne sont pas si parfaits).
Pour ce qui est de la préparation des protéines pour la digestion trypsique en vue d'identification par empreinte peptidique, le protocole que nous avons adopté est disponible ici. C'est un hybride entre la technique utilisée par l'équipe de Jérôme Garin au CEA de Grenoble (que nous remercions pour l'organisation de l'excellent atelier inserm 115 en Mai 2000 avec JC Sanchez) et la technique employée chez Jean Rossier par Jean-Pierre Le Caer et Valérie Labas à l'ESPCI que nous remercions également pour nous avoir initié un beau jour de Juin 1999.
Le site de l'équipe Joubert-Caron à Bobigny (Gels bidi et protocoles) est très complet pour tout ce qui concerne les deux dimensions. Ils organisent des ateliers à Paris et un symposium annuel à Paris XIII.
Voici les sites web de Julio
Celis (site "furtif" souvent déplacé) d'Angelika
Görg, (organise des ateliers à Munich) et de Jean-Charles
Sanchez (Organise des ateliers à
Genève).
Tous proposent des protocoles et des conseils pratiques,
éprouvés
depuis longtemps.
Liens
vers la masse...
Un peu d'histoire sur la spectrométrie de
masse
grace à un spectre de temps de vol allant jusqu'à un
siècle
avec un peu de fragmentation (ou MS/MS historique):
(D'après
http://masspec.scripps.edu/timelines.html
)
Pour les protocoles relatifs à la spectrométrie de masse: la page de liens de l'ESPCI (équipe J. Rossier) est très complète. Eux aussi organisent des ateliers à Paris. Nos protocoles de digestion trypsique et les produits utilisés sont répertoriés ici.
Par ailleurs, un réseau d'informations sur la spectrométrie de masse appliqué à la biologie existe depuis 5 ans:
Ce réseau appelé "MS-BIO" a été créé sous la dynamique de Virginie Redeker (ESPCI,Paris)), Olivier Laprevote (ICSN, Gif sur Yvette) et de Catherine Auvin (labo de chimie du MNHN). Le but de ce réseau est d'organiser tous les deux mois environ une réunion rassemblant des spécialistes de la spectrométrie de masse et des biologistes intéressés par cette technique. Par ailleurs la liste de diffusion Email permet de diffuser autant que possible des annonces de séminaires relatifs à la spectrométrie de masse "biologique".
Enfin, depuis Novembre 2000, un spectromètre de masse de type "MALDI-TOF" est opérationnel à l'Institut Jacques Monod, tour 46 à Jussieu. Il permet notamment l'identification de protéines à partir de leur empreinte peptidique ce qui implique que les protéines recherchées appartiennent aux génomes séquencés ou partiellement séquencés. Cet appareil est à l'usage des communautés scientifiques du MNHN (50% de l'investissement), de l'IJM et de l'IFR de l'Hopital Bichat (50% de l'investissement). Il est aussi ouvert à d'autres utilisateurs externes. Contacter:spectrodemasse@ijm.jussieu.fr) .
Un deuxième appareil de
spectrométrie
de masse de type "Quadrupole-TOF" est installé au laboratoire de
Chimie du MNHN. Il permet le
séquençage
de peptides et de protéines sans nécessiter de
connaissances
préalables des génomes d'organismes
étudiés.
Entièrement financé par le Muséum, il permet
l'étude
de protéines d'organismes dont la connaissance des
génomes
reste peu ou pas connue (et il y en a beaucoup au muséum!)
grâce à ses extraordinaires
possibilités
de fragmentation d'ions.
Moteurs
de recherche d'empreinte peptidique...
ProFound:
standard
ou dans sa version
longue issu
de la collaboration entre ProteoMetrics
et la Rockefeller University.
Rapide et efficace… capable de retrouver l'identité d'une
protéine dont quelques masses de peptides sont noyés au
milieu de plusieurs centaines de masses non spécifiques
(à conditions que l'appareil de MS ait été
finement
calibré). Il n'y manque que trois choses: l'affichage du
recouvrement
de séquence sur la page résumée des candidats
trouvés,
et la possibilité de se faire envoyer les résultats par
Email,
ou de sauvegarder ces résultats dans un format permettant de
re-soumettre
la recherche 6 mois plus tard sans rentrer à nouveau tous les
paramètres.
A part ça on apprécie beaucoup la possibilité de
rechercher
un mélange de plusieurs protéines, et de rechercher
d'autres
protéines avec les masses qui n'ont pas collé avec le
premier
résultat.
Le
Must: la page de résultats détaillés de
chacune
des protéines candidates est admirablement lisible et des
graphiques
permettent de se faire une idée instantanée sur la
plausibilité
de l'identification! Dommage qu'on ne puisse pas la sauvegarder
facilement.
Peptident:
basé sur "Swiss prot", une sérieuse banque de
données
non redondantes hébergée par ExPASy
(Expert Protein Analysis System). Le site est très riche
d'outils
bioinformatiques grâce à l'Institut Suisse de
Bioinformatique
(SIB). Le moteur est quand
à lui un peu lent et
la page de résultats difficile
à déchiffrer… Mais il permet de recevoir le
résultat
par Email, ou de sauvegarder la page localement. La recherche est
immédiatement
renouvelable d'un simple clic!
En Octobre 2004, "Aldente"
développé probablement (je n'ai pas trouvé les
reférences des développeurs) par le SIB, permet une plus
grande souplesse d'utilisation, avec un nouvel algorithme, et une
rapidité d'exécution quasi égale à celle de
Profound. Je n'ai pas encore le recul me permettant de dire que c'est
le meilleur moteur, toutefois les options disponibles sont très
riches et une visualisation graphique permet de mieux évaluer la pertinence des résultats. Il est aussi possible de
tracer les contaminant et d'éliminer les masses de
protéines déjà identifiées! De quoi
identifier des protéines avec des données de masse qui
auparavant et sur d'autres moteurs ne me permettait aucune conclusion
(j'en ai fait l'expérience!).
Encore une remarque cependant, la lisibilité de de la page
d'entrée des données et de celle des résultats
restent encore un peu "austère". L'insertion d'une version
condensée et en "gif" du "biographe" dans la page de
résultats sans devoir passer par l'applet java serait plus pour
la simplicité.
Mais... respect tout de
même: Nous sommes très admiratifs devant les
trésors d'ingénierie développés pour
développer et permettre l'accès à de tels outils
par les communautés scientifiques internationales. Bravo et
grand MERCI !
Mascot:
mis à disposition par Matrixscience dont vous trouverez ici
la référence bibliographique principale. Le moteur est
basé
sur les algorithmes de Mowse
hébergé par l'Imperial Cancer Research Fund à
Londres.
Assez rapide, ce moteur ne demande pas d'information de pI, et
l'entrée
de la masse moléculaire est indicative, elle n'exclut pas de
candidats,
ce qui peut-être avantageux dans le cas de protéines
tronquées.
Les résultats sont envoyés par Email si vous n'avez pas
la
patience de les attendre. Enfin il intègre les modifications
telles
que celles apportées par la technologie ICAT.
Les informations sont un peu trop brièvement
résumées
mais si ils ne sont pas sauvegardés sur votre disque dur, ils
sont
toujours accessibles sur celui du moteur (à condition
d'enregistrer
l'adresse). Il ne donc faut pas être trop parano...
Msfit:
est un moteur mis à la disposition des chercheurs avec d'autres
outils par l'université de Californie à San Francisco
(UCSF
Mass Spectrometry Facility) sous la forme de "protein
prospector". Il intègre les modifications telles que celles
apportées par la technologie ICAT. D'autres moteurs que nous
n'avons
pas testé y sont indiqués.
Atelier...
