Préparation de l'échantillon
    Solubilisation
       Tissus
       Cellules en culture
       Micro-organismes

Réhydratation

Migration

    1^ère dimension
        Chargement par réhydratation
        Chargement par cupule
        Voltages appliqués

    Equilibration

    2^ème dimension

Transfert

South- et North-Western blot

Coloration
    Bleu de Coomassie
    Argent

Conservation des gels

Microanalyse des protéines et recherche d'empreinte peptidique
    Digestion trypsique
    Extraction des peptides
   Spectrométrie de Masse MALDI

Liste et références des produits utilisés

Reférences bibliographiques

    Chaque échantillon protéique a ses caractéristiques propres. Un échantillon idéal serait dénué de sels, d'acides nucléiques, et serait soluble dans l'eau même à forte concentration (bref, de l'albumine purifiée quoi!). C'est rarement le cas, mais heureusement un tas d'astuces ont été mises au jour depuis la première description de l'électrophorèse bidimensionnelle en 1975 par O'Farell (2). Un grand nombre d'améliorations ont notamment été décrites par les travaux de Thierry Rabilloud concernant la solubilisation de protéines (3).
Notons aussi comme améliorations significatives:

-la réhydratation des gels en incluant les protéines solubilisées à la solution de réhydratation permet d'augmenter notablement les capacités de charge des gels (4 - 5).
-l'utilisation d'urée et de thiourée solubilise les protéines même à forte concentration (6).
-les détergents non ioniques ou zwitterioniques évitent l'aggrégation des protéines entre elles lorsque celles-ci ont des domaines hydrophobes. Toutefois les domaines transmembranaires des protéines membranaires sont généralement trop hydrophobes pour permettre une solubilisation totale des protéines (7).
-Le DTT ou la tributyl phosphine (8) maintient les groupements -SH réduits, afin de ne pas oxyder les protéines ou provoquer des ponts di-sulfure inter-protéines.
-L'utilisation de polycations tels que la spermine ou la spermidine condense les polyanions que sont les acides nucléiques (9), permettant leur séparation des protéines par centrifugation lorsque des noyaux de cellules sont lysés.

Solution de solubilisation (en général):

Très souvent, chaque échantillon demandera une optimisation particulière, dans bien des cas cependant les protocoles simples sont les plus rentables. Les "recettes" suivantes sont cependant applicables dans les cas généraux:

Solution: 7 à 8M urée, 1 à 2M thiourée, 2-4% CHAPS, 50mM de DTT, 30mM spermine base (à ajouter s'il y a des acides nucléiques puis ultracentrifuger). Le CHAPS peut-être remplacé par de l'octyl glucoside pour une meilleure solubilisation des protéines hydrophobes et le DTT par du trybutyl phosphine, qui lui n'est pas chargé (8). Eventuellement, ajouter les ampholytes correspondant au gradient de pH étudié.

Pour des tissus:
    La meilleure option est en général de broyer les tissus sous azote en poudre fine, puis, juste après évaporation de l'azote, de verser la poudre dans la solution sous agitation décrite ci-dessus.

Pour des cellules en culture:
    Les cellules décollées puis centrifugées doivent être lavées de préférence dans une solution de saccharose isotonique (plusieurs fois si le milieu de culture contient du sérum!). Le culot est alors noyé et immédiatement homogénéisé dans un minimum de la solution décrite ci-dessus.

Dans les deux cas de figure, l'utilisation de spermine est recommandée afin de se débarasser des acides nucléiques.

Préparation d'extraits cytoplasmiques et nucléaires d'après Dignam et col (10):
Ce protocole très répandu permet de dissocier les deux fractions par chocs hypo et hypertoniques. L'élimination des sels est obligatoire, mais l'utilisation de spermine n'est plus nécessaire (les noyaux ne sont pas lysés).

Pour des microorganismes:
    Nous n'avons pas beaucoup d'expérience sur l'extraction des protéines de ce type, cependant, les protéases très souvent produites par ces organismes doivent impérativement être inactivées (inhibiteurs de protéases et dénaturation instantanée sont les meilleurs moyens) pour éviter la protéolyse de l'échantillon.

Réhydratation

    Les bandelettes de gels de 1ère dimension se présentent déshydratés. Elles doivent être réhydratées avec une solution de réhydratation contenant les ampholytes correspondant au gradient de pH utilisé. Si l'application des protéines (voir paragraphe suivant) se faisait initialement par dépôt sur une cupule en contact avec le gel pendant l'application du courant, elle se fait désormais très souvent par l'intermédiaire de la solution de réhydratation dans laquelle est dilué l'échantillon préparé comme indiqué ci-dessus. Cette méthode permet notamment d'introduire bien plus de protéines dans le gel.

Migration:

1ère dimension
    Nous utilisons un système Multiphor II distribué par Pharmacia.

Ce système permet à moindre coût la focalisation de 12 gels à gradient de pH immobilisé (IPG). Très souple d'emploi, il permet d'utiliser des IPG réhydratés avec l'échantillon (incorporation "passive"), ou rehydratés sans échantillon mais en chargeant celui-ci au moment de la focalisation (incorporation "active" de l'échantillon) à l'aide de cupules. Ces deux modes d'incorporation ont chacun leurs avantages et inconvénients, notamment:

Chargement par réhydratation: Les protéines les plus grosses pénètrent moins rapidement dans le gels, aussi ne faut-il pas surestimer le volume de solution de réhydratation, au risque d'enrichir en protéines de plus faibles masses moléculaires, et de laisser au dehors les plus grosses protéines. Les quantités de protéines chargées par gel dépassent souvent le milligramme!

Chargement par cupules: Les protéines pénètrent dans le gels sous l'influence du courant et du pH local, par une petite "fenêtre" constituée par la base de la cupule.

Le problème le plus fréquemment rencontré est une concentration importante de protéines à l'interface du gel et de la cupule avec risque de précipitation des protéines les moins chargées (formation d'un "bouchon cotonneux" car les protéines se bousculent à l'entrée...). Si la quantité de protéines ainsi chargée est limitée, les protéines les plus grosses sont activement entraînées dans le gel.
 
 

Dans tous les cas, nous réfrigérons le plateau du multiphor II par circulation d'eau à 18°C.
Cela évite la réaction de l'urée avec les protéines (carbamylation) qui intervient à de plus hautes températures, et c'est suffisant pour éviter la précipitation de l'urée en cristaux. Un peu d'huile minérale entre chaque compartiment assure une bonne diffusion thermique, et une couche d'huile minérale sur les IPG pendant la migration prévient l'évaporation de l'eau du gel.
 
 

Voltages appliqués: Les paramètres de migration sont en général à optimiser en fonction de l'échantillon (salinité, pI des protéines  chargées, quantité) du mode de chargement et du gradient employé.
Il est préférable d'utiliser un générateur programmable capable de faire varier le voltage en fonction du temps et de l'intensité, toutefois un simple appareil fonctionnant à voltage constant peut tout à fait suffire si on intervient de temps en temps pour suivre et modifier le voltage. Les générateurs haut voltage permettent en général de produire de 1000V à 10 000V en fonction de leurs normes de sécurité. En général le courant débité ne frôle pas le dixième d'un ampère; même pour 12 gels, d'autant que la limite raisonnable est de 50µA par gel. Toutefois il n'est pas rare qu'en début de migration les sels (ions) présents augmentent l'intensité jusqu'à plus de 100µA par gel. Il ne vaut mieux pas que cela dure au delà de quelques minutes car les risques d'échauffement et de dégradation du gel sont très importants. En général, l'intensité décroît rapidement au fur et à mesure que les ions s'évacuent (il faut donc plus de temps pour les gels de grande taille (18 ou 24cm). Il est donc important de surveiller les premières minutes de migration. Lorsque l'intensité diminue alors que le voltage grimpe (dans le cas d'un appareil gérant les gradient de voltage), la focalisation est sur la bonne pente. Si ces deux valeurs augmentent, il convient de diminuer la pente du gradients de voltage en allongeant sa durée. Si l'intensité est forte dès le début, il faut démarrer à une valeur de voltage plus basse (100 ou 150V au lieu de 200 ou 300V). Tous ces paramètres sont essentiellement dépendants de la composition de l'échantillon (tampons, sels, concentration), de la pureté des composants des solutions (eau milli-Q ou bidistillée, ampholytes, urée, CHAPS, etc...), et du nombre de gels à focaliser. Il convient donc de diviser l'intensité par le nombre de gels pour connaitre l'amperage/gel. Toutefois ce n'est qu'une approximation, car la répartition de l'intensité n'est pas égale d'un gel à l'autre, surtout si les échantillons sont différents.
En règle générale, la qualité de la focalisation est inversement proportionnelle à la quantité de composants non protéiques présents (sels, tampons et acides nucléiques en général), voir plus haut Préparation de l'échantillon.

    Voici quelques uns des protocoles utilisés pour des échantillons dépourvus de sels et d'acides nucléiques (préparés selon Dignam ou selon Rabilloud):    Pour 100 à 200µg de protéines, et en utillisant les gels pH 3-10 et pH 4-7, les valeurs fournies dans le document "2D-Electrophoresis: principles and methods" par Berkelman and Stenstedt sont en général valables (tableau pdf).
    Pour les gels de pH 6-11, notre expérience nous a amené à employer le chargement anodique par cupules de 50 à 250 µg de protéines mais en multipliant les quantités totales de V.h par 3 fois les valeurs utilisées pour un pH 4-7.
    Pour les gradients de pH étroit (une unité), les données fournies par le constructeur nous ont donné satisfaction concernant les gradients 4,5-5,5 et 5-6 avec un excellent recouvrement de la zone commune entre les deux gradients.

Equilibration:

    La migration en deuxième dimension doit se faire selon la masse de chaque protéine, ce qui implique l'uniformisation des charges. La technique du SDS PAGE est donc traditionnellement employée. Toutefois il est difficile de faire bouillir la bandelette de 1ere dimension pour dénaturer les protéines. En fait une équilibration de dix minutes dans une solution d'urée 6M, de glycérol 30%, de SDS 2% et de DTT 65mM (extemporanément) dans 50mM de tris pH 8,8 remplace très bien la dénaturation selon Laemmli.
    Dans le cas où une microanalyse des protéines est prévue par spectrométrie de masse, il est possible de bloquer le groupement -SH des cystéines par 10 minutes de carbamidométhylation à l'iodoacétamide à 55mM (extemporanément dans la même solution d'équilibration mais sans DTT). Ainsi traités, les bandelettes doivent aussitôt être placées sur les gels de 2ème dimension.

Seconde dimension:

    Nous utilisons un système type ISO-DALT distribué par Hoefer-Pharmacia.
Les gels sont moulés par 12, sans stacking, il ne doit rester que 5-10mm pour placer la bandelette au dessus du gel. Elle est stabilisée en contact avec le gel en versant de l'agarose 1,4% (low melting dans du tampon de migration à moins de 50°C au moment de l'utilisation).
    Des marqueurs de poids moléculaire ou de l'échantillon brut, mélangés avec l'agarose 1,4% à raison de 50/50, peuvent être déposés de chaque coté de la bandelette si des puits sont aménagés dans l'agarose (disposer des espaceurs avant de couler l'agarose, et retirez-les après refroidissement).
    Pour pouvoir retourner les gels et les placer dans la cuve, il convient de laisser l'agarose en haut du gel se solidifier 10 minutes à 4°C.
Les Gels sont alors soumis à 120-150V dans du tampon d'électrophorèse classique (25mM TRIS, 192 mM Glycine, 0,1% SDS) pour la nuit avec refroidissement actif de la cuve à 5-7°C (réfrigérant à -1°C).

Après migration, les gels peuvent être soit:
    -transferés sur membrane afin de rendre les protéines plus accessibles à d'autres molécules (Western-blots, south- et North-western blots).
    -colorés afin d'obtenir une image des protéines séparées.

Transfert des protéines sur membrane

    Après démoulage, il est pratique de repérer la face du gel où se trouvent les protéines. En effet, celles-ci migrent le long d'une des deux plaques du gel, précisément celle qui se trouvait contre la face plastifiée de la bandelette. Cette face du gel devra se trouver contre la membrane de nitrocellulose/PVDF lorsque sera effectué l'électrotransfert, facilitant notablement le transfert.
    Après un bref rinçage dans de l'eau distillée puis dans le tampon de transfert (tampon identique à celui de la deuxième dimension mais sans SDS), le gel est étendu sans piéger de bulles (à réaliser soit en immersion dans une bassine de tampon de transfert, soit en arrosant de tampon entre les composants avant de les unir) sur une membrane de nitrocellulose découpée aux dimensions du gel et équilibrée dans le tampon de transfert en prenant les repères dimensionnels (acide-basique, haut-bas poids moléculaires).
    Le montage en sandwich : Cathode(-)/éponge/whatmann 3MM/gel/membrane/whatmann 3MM/éponge/Anode(+) est placé dans la cuve ISO-DALT (22Litres de tampon à 4°C) et le transfert s'effectue sous 1 ampère pendant 2h30 avec réfrigération active (il dégage 60-70Watts au démarrage). Si 5 autres gels doivent attendre leur tour, ils peuvent être placés à 4°C pour éviter une diffusion notable des protéines. En général un des gels n'est pas transféré afin de le colorer pour juger de la qualité des deux dimensions.

    Lorsque le transfert est terminé, il est possible de visualiser les protéines et la qualité du transfert par :
-coloration transitoire (rouge ponceau à 0,1g dans 100ml d'acide acétique 1%) pendant une minute et décoloration à l'eau sous agitation légère (la décoloration des protéines est très rapide mais néanmoins plus rapide là où il n'y a pas de protéines...).
-coloration permanente non dénaturante (non testée pour les south/north-western blots): il s'agit d'une suspension filtrée d'encre de chine à 0,1% (classiquement dans du PBS ou du TBS) pendant 20-30 minutes et rincée au PBS ou TBS.
-coloration permanente dénaturante: Le bleu de coomassie ou le noir amidon à 0,1% dans de l'éthanol 10% + acide acétique 5% en 15 minutes se décolore en plusieurs bains de la même solution.

    Conservation des membranes: Les protéines devant être natives pour les expériences de south/north-western blots, les membranes doivent être utilisées dans les 72h: la conservation doit se faire dans la solution de renaturation à 4°C. Au delà, la perte d'activité est notable. Après incubation, la membrane peut-être brièvement égouttée pour une exposition rapide afin de vérifier le lavage de la sonde en excès. Pour une exposition longue, la membrane doit être complètement séchée pour éviter la diffusion de la radioactivité. Le sechage condamne toute autre incubation en south/north-western blot. En revanche il est toujours possible de réaliser des immuno-détection (western-blot), même après des mois de conservation (au sec et à l'abris de l'air).

Révéler des protéines par incubation avec des acides nucléiques ou des anticorps
    L'incubation des membranes avec des acides nucléiques radiomarqués afin de révéler d'éventuelles protéines reconnaissant ces molécules nécessite un bon état des protéines. Au cours de chacune des étapes précédentes, les protéines doivent avoir subi le minimum de "stress" (purifications avec précipitation, chauffage pour dénaturer, etc...). Le SDS doit avoir été éliminé par le transfert, mais cette élimination peut être plus poussée (avec emploi d'un chaotrope en dilutions successives par tranches de 10 minutes), ou plus simplement par lavage une heure à 4°C dans la solution qui servira à incuber les acides nucléiques (solution d'hybridation: HEPES pH 7, 50mM, 1mM DTT (extemporanément), MgCl2 5mM, NaCl 50 à 150mM, EDTA 1mM, Tween20 0,05%).

    Lors de l'incubation avec les acides nucléiques, les sondes radiomarquées sont introduites après les compétiteurs non spécifiques dans les proportions adéquates. Une heure à une nuit d'incubation suivie de deux à trois lavages de 10 minutes dans la même solution mais sans acides nucléiques suffisent en général pour obtenir un bon rapport signal/bruit. L'expostion est classiquement effectuée sur films autoradioradiographiques, instant-imager ou plaques radiosensibles phosphorescentes (phosphorimager).
La comparaison de l'image des protéines révélées avec celle des protéines colorées permet d'annoter les protéines d'intérêt sur l'image des protéines colorées (voir exemple page 2D-Southwestern) afin de les soumettre à une microanalyse en spectrométrie de masse.

    Lors d'un southwestern blot, il n'est pas nécessaire de passer par une étape de renaturation, en revanche, il faut complètement saturer la membrane avec des protéines non spécifiques (lait écrémé en poudre 5% et/ou BSA 3% au moins une heure sous agitation douce) pour éviter que les anticorps eux-mêmes ne soient adsorbés non spécifiquement. Cette opération peut succéder à un south- ou north-western blot, mais pas l'inverse. Classiquement un premier anticorps spécifique d'une protéine recherchée est incubé 1h à une nuit en fonction de sa dilution, puis rincé plusieurs fois avant d'être à son tour ciblé par un anticorps couplé à une enzyme de révélation. Après plusieurs rinçages, un réactif coloré ou luminescent par action de l'enzyme est ajouté, révélant la position de la protéine recherchée soit directement par coloration, soit par exposition à un film photosensible.

L'ensemble de ces manipulations permet de cumuler plusieurs détections sur la même séparation: Gel coloré, gel transferé puis révélé par sonde oligonucléotidique, et enfin par western-blot. Ce qui donne trois images comparables dont 2 absolument superposables.
 

Coloration des gels

    L'emploi d'eau bidistillée est hautement recommandée si les gels doivent servir à prélever des protéines pour la spectrométrie de masse et/ou pour la coloration à l'argent. Par ailleurs, les bassines (verre ou plastique) utilisées pour toutes les opérations suivantes doivent être très propres, dénuées de traces de détergent ou de colorant, et non rayées (l'emploi d'éponges abrasives pour le nettoyage est proscrit).

    Les gels en fin de migration sont placés sous agitation lente pour tous les traitements suivants: ils sont brièvement rincés dans de l'eau bidistillée (2-3 minutes) avant d'être tout d'abord fixés dans un mélange eau bidistillée/méthanol/acide acétique (55/35/10) pendant au moins 30 minutes. Le méthanol chasse peu à peu le SDS des protéines qui deviennent alors plus avides de colorant.

Au bleu de Coomassie:

    Il est utilisé à raison de 0,025-0.05% dans le mélange fixateur décrit ci-dessus. Différentes déclinaisons de ce colorant existent: G250 (bleu ciel, utilisé dans les kits de coloration sans acide acétique et sans méthanol), R250 (bleu plus sombre), et R350 (bleu violacé). Il est recommandé de filtrer ces solutions afin d'éviter certains précipités inesthétiques sur l'image d'un gel, ce qui complique les comparaisons informatiques.
    La décoloration s'opère soit avec les mêmes solvants, ou bien en mélange un peu moins riche en méthanol et acide acétique (65/30/5). Il est possible d'utiliser de l'éthanol à 10% au lieu du méthanol (toxique) à 30%, toutefois le gel se contracte davantage et une décoloration trop poussée décolore les protéines.
    Un premier bain de rinçage dans un faible volume (50 mL) pendant 2 minutes élimine l'excès de colorant, le second bain de 1 à 2 heures dans un grand volume (200-400 mL) doit décolorer efficacement le gel afin que les protéines apparaissent sur un fond transparent. Plusieurs bains peuvent être nécessaires en fonction de la taille et de l'épaisseur du gel.

    Astuce économique: Ces solutions de décoloration peuvent être réutilisées après usage moyennant un passage sur charbon actif. Ce même produit (utilisé avec une granulosité de quelques millimètres et emprisonné dans une poche de nylon à mailles très serrées pour éviter qu'il ne se répande dans la solution) peut également être utilisé directement dans le bain de décoloration. Les bains successifs sont alors inutiles.

Afin de conserver le gel:

        Humide:   Il est conseillé de lui faire subir un dernier bain de 1-2% d'acide acétique (conserve la coloration et préserve des moisissures) avant de le stocker sous plastique (films thermosoudables ou porte-transparents bien refermés et en atmosphère humide).

        Sec:         Il faut éliminer tout l'acide acétique par des bains d'eau et utiliser 2-3% de glycérol dans le dernier bain pour donner au gel un peu plus de souplesse et éviter qu'il ne se fendille pendant ou après le séchage. Le séchage sur papier se fait à chaud et sous vide à l'aide d'un piège à eau réfrigéré. Le séchage entre deux feuilles de cellophane, plus difficile à réaliser pour des grand gels, se fait sans appareillage lourd mais l'ajout de glycérol est hautement recommandé pour éviter que le gel sec ne se roule comme un parchemin.

Coloration à l'argent:

    Nous utilisons principalement le protocole décrit sur les deux sites ci-après (avec quelques variations entre les deux). Dans les deux cas, les temps de rinçage, exprimés en secondes, doivent être scrupuleusement observés. Cette coloration peut tout à fait être utilisée après coloration au bleu si cette dernière n'a pas donné de résultats satisfaisants (trop peu de protéines). C'est le cas des gels sur les figures 1 et 3b. Attention, coloration à l'argent signifie manque de reproductibilité, car l'intensité de coloration varie d'une protéine à l'autre et quelquefois sans grande corrélation avec la quantité de protéines présentes. Par ailleurs, c'est une coloration plus rapide sur les protéines que dans le gel, ce qui signifie qu'une coloration prolongée colorera aussi le gel... partout!

Sur le site de Corthals et col.:
http://www.garvan.unsw.edu.au/public/corthals/HTML-protocols/silver_staining.html
Ce dernier site propose une fixation sans formaldéhyde ni glutaraldéhyde et un protocole de décoloration, ce qui peut-être pratique en cas de ratées ou pour une analyse en spectrométrie de masse.

Pour la conservation, voir ci-dessus.

Microanalyse de Protéines pour la recherche d'empreinte peptidique massique:

Digestion trypsique dans le gel:

    Les spots d'intérêt sont soigneusement (environnement sans poussières ni empreintes de doigts) excisés en morceaux d'1 ou 2 mm³ et placés dans des microtubes très propres. Ils sont lavés deux fois 20 minutes dans 1 mL NH4HCO3 25mM sous agitation. Puis 15 minutes dans 1 mL de 50% acetonitrile - 50 % NH4HCO3 25mM (effet d'expulsion de l'eau et des sels dissouts). Le surnageant est à nouveau remplacé par 1 mL NH4HCO3 pendant 15 minutes sous agitation, et enfin par 1 mL d'eau bidistillée, toujours sous agitation. Ensuite, l'eau est retirée et les portions de gels sont lyophilisées jusqu'à évaporation totale.

Les réactions de réduction au DTT et d'alkylation à l'iodoacétamide peuvent être évitées si l'échantillon a subi ces étapes entre la 1ère et la 2ème dimension. Elles sont recommandées pour des protéines extraites de gels 1D, ou si la protéine est exceptionnellement riche en cystéines.

La réhydratation des morceaux de gels deshydratés est opérée avec 1,5 fois le volume estimé du gel lors de sa découpe (4,5 µL pour un spot de 3 µL) la solution de réhydratation se compose de trypsine à 12,5 ng/µL dans 5mM de CaCl2, 25 mM de NH4HCO3. La trypsine est initialement dissoute dans 20 µL d'acide trifluoroacétique 0.01% (solution activée 100x concentrée). L'incubation a lieu pendant la nuit à 37°C sous agitation si possible, ou bien dans une étuve humide, suivie par 2 heures sous agitation à température ambiante après ajout de 5µL d'eau bidistillée.

Extraction des peptides:

    Après récupération du surnageant éventuel, les gels sont lavés dans 20 µL d'acide formique 1% pendant 10 minutes sous agitation. Le surnageant est collecté et regroupé avec le précédent. Le liquide contenu dans les morceaux de gels est alors extrait par de l'acétonitrile 100% pendant 10 minutes toujours sous agitation. Le surnageant est de nouveau regroupé et l'ensemble évaporé au speed-vac. Une fois évaporés, les peptides sont redissouts dans 10 µL d'acide formique 1% et dessalé sur micro colonnes Zip-Tip^tm C₁₈ (millipore) comme suit:

Le Zip-tip est activé par 3 lavages de 20 µL acétonitrile/acide formique 1% (1/1), puis équilibré par 3 lavages de 20µL d'acide formique 1%. Les peptides sont lentement aspirés et refoulés 10 fois dans le Zip-Tip puis lavés de leurs sels par 3 x 20 µL d'acide formique 1%.

L'élution a lieu avec 5µL du mélange acétonitrile/acide formique 1% (1/1), une étape supplémentaire avec 5µL d'acétonitrile à 80% permet d'éluer des peptides plus hydrophobes. Les peptides élués sont concentrés au speed-vac puis stockés à -20°C en attendant leur dépôt sur cible MALDI ou passage en MS/MS.

Spectrométrie de Masse MALDI:

Les peptides sont redissous dans 3 µL d'acide formique à 1% sous action d'un bain à ultrasons. La matrice employée est une solution saturée de 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%. L'échantillon et la matrice, à raison de 0,5µL chacun, sont déposés puis mélangés sur la cible MALDI selon la technique "dried droplet". Les spectres MALDI-TOF des peptides sont acquis avec un appareil "Voyager–DE STR" (PE Biosystems Inc., Courtaboeuf, France) à l'ESPCI ou "Voyager DE Pro" (PE Biosystems) de la plate-forme protéomique MNHN-IJM. Les analyses sont menées en mode positif avec reflecteur, sous 20.000V d'accélération et 200ns de délai d'extraction. 250 acquisitions sont accumulées pour obtenir un spectre. Le logiciel "Data Explorer" (PE Biosystems) est utilisé pour l'analyse du spectre. Les Spectres obtenus sont calibrés en externe avec les ions [M+H]+ des peptides Des-Arg Bradykin  (Mr 904,4681 Da) et ACTH (Mr 2465,1989 Da). L'autoprotéolyse de la trypsine produit des ions utilisés comme étalons internes (fragment 132-142 , Mr 1153,57 Da et fragment 56-75 , Mr 2163,06 Da).

Liste des produits utilisés avec les références fournisseurs:

Urée 1kg: U-5128-1kg (Sigma)

Thiourée 100g: T-7875-100 (Sigma) (toxique)

SDS 500g: 15525-017 Life technologies (Gibco)

Benchmark protein ladder 500µl: 10747-012  Life technologies (Gibco)

Acrylamide:Bis-Acrylamide 30%T, 37.5:1 500ml: 10325-017 Life technologies (Gibco) (toxique)

Membrane de nitrocellulose "Hybond ECL" 3mx0,3cm ref RPN 303D (Amersham pharmacia)

Glycerol 500ml: 15514-011  Life technologies (Gibco)

Bleu de Comassie R350 "phastgel tablets": 17-0518-01 (Amersham pharmacia)

CHAPS : 1g ref 17-1314-01 (Amersham pharmacia)
Remplaçable par le n-Octyl glucoside plus efficace pour les protéines hydrophobe (travaux de Rabilloud T.) produit dispendieux s'il en est... ref O9882 (Sigma)

DTT: 5g 17-1318-02 (Amersham pharmacia)
remplaçable par du trybutyl phosphine (non chargé) à 2-5mM  (8) ref T7567 (Sigma)

Iodoacétamide: 100g  i-1149-100 (Sigma) (toxique)

Trypsine (bovine) par 4x25µg "sequencing grade": 1 418 475 (Roche)

Spermine base dihydrate 238.8g/mol : ref 85588 (fluka)

acide trifluoroacetique 50ml: 1.08178.0050 (Merck) (très corrosif)

Ammonium hydrogéno carbonate 500g: 10700 (Fluka)

Acetonitrile 500ml "gradient grade" 1.00030.0500 (Merck) (toxique)

Zip-Tips c18 en boites de 8, 24, 96 ou 960
ref ZTC18S*** (où ***=008,024,096 ou 960) (Millipore)

pour le reste, les produits doivent être aussi purs que possible et pas trop poussièreux
(kératines....)

Références bibliographiques:

1. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M. (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels, Anal. Chem., 68(5), 850-858.

2. O'Farrell, P. H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J. Biol. Chem. , 250(10), 4007-21.

3. Rabilloud, T. (1996) Solubilization of proteins for electrophoretic analyses, Electrophoresis, 17(5), 813-29

4. Rabilloud, T., Valette, C. and Lawrence, J. J. (1994) Sample application by in-gel rehydration improves the resolution of two- dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients in the first dimension, Electrophoresis, 15(12), 1552-8.

5. Sanchez, J. C., Hochstrasser, D. and Rabilloud, T. (1999) In-gel sample rehydration of immobilized pH gradient, Methods. Mol. Biol. , 112, 221-5

6. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A. and Lunardi, J. (1997) Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis, 18(3-4), 307-16.

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