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| STRUCTURE ORIGINALE D'UN INHIBITEUR (McaPI) ISOLEE CHEZ UNE GORGONE DE NOUVELLE-CALEDONIE |
Jean PEDUZZI, Arlette LONGEON, Michèle GUYOT
et Michel BARTHELEMY |
Introduction
Les protéases constituent un groupe d'enzymes d'une importance capitale dans un grand nombre de processus physiologiques. L' élastase leucocytaire humaine (ELH) est une protéase à sérine intervenant dans de nombreux processus inflammatoires. Le dysfonctionnement de son inhibition naturelle est impliqué dans des pathologies comme l'emphysème pulmonaire, la bronchite chronique, le syndrome de détresse respiratoire, la mucoviscidose, l'arthrite rhumatoïde ou le psoriasis. Il existe de très nombreuses familles d'inhibiteurs des protéases à sérine : Bowman-Birk, Kazal, Kunitz (BPTI), Kunitz (soja), Serpine, SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor), WAP (Whey acidic protein),
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Melithaea
Melithaea caledonica [1] est un cnidaire appartenant à la classe des Anthozoaires. Elle n'a été observée que dans la zone récifale au sud-ouest de la Nouvelle Calédonie à une profondeur de 20 à 30 mètres [2]. |
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Premiers résultats
Une activité inhibitrice de l'élastase pancréatique porcine (EPP) avec un Ki de 1,5 10 -9 M a été isolée par S. La Barre et al [3].
La séquence N-terminale des 39 premiers résidus montre une homologie avec les inhibiteurs de type Kazal.
La masse moléculaire est de 21 159 daltons (MALDI-TOF-MS).
Cependant :
Rendement de purification < 1%.
Masse moléculaire incompatible avec un simple domaine inhibiteur (50 à 60 résidus).
Action sur l'élastase leucocytaire humaine ?
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Purification de l'inhibiteur de protéases (McaPI)
- L'extrait brut est obtenu par extraction méthanolique en présence d'acide acétique 1M.
- Le point isoélectrique, mesuré par isoélectrofocalisation en veine liquide (gradients d'ampholytes et de sucrose, est de 5,05.
- La purification est réalisée en 3 étapes de chromatographie.
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| La détermination de la composition en acides aminés de McaPI révèle l'existence de 24 résidus de cystéine. Ceci suggère l'existence de plusieurs domaines à activité inhibitrice, chacun pouvant posséder 6 à 8 cystéines impliquées dans la formation de ponts disulfures. |
Détermination de la structure primaire
Carboxyméthylation des cystéines par l'iodoacétate après réduction des ponts disulfures.
Digestion de McaPI par la trypsine ( T ), l'endoprotéinase AspN ( D ) et la chymotrypsine ( CT ).
Séparation des peptides par CLHP sur colonne C18 (pH 2,0 et pH 6,0).
Détermination de la séquence des peptides par la méthode de Chang à l'aide du DABITC [4]. |
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* Existence d'un variant Met / Val
McaPI est une protéine de 197 résidus (SwissProt P82968) |
Recherche d'homologie de séquences par FASTA |
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Organisattion de la structure primaire de McaPI
L'inhibiteur est constitué de 4 domaines associés en tandem.
Les espaces interdomaines sont très courts (2 ou 3 acides aminés).
Les 3 premiers domaines sont de type Kazal "non classique" (position des cystéines).
Le domaine C-terminal est de type Kunitz. |
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Originalité de la structure primaire
Il existe de nombreux domaines multiples de type Kazal : ovomucoïde (3), ovoinhibiteur (7) ou LEKTI (15).
Les associations en tandem de différents types de domaines sont très rares : chélonianine chez la tortue, protéine WFIKKN chez l'homme,
( Wap - Kunitz BPTI).
Chez Anemonia sulcata (anémone de mer), on rencontre des inhibiteurs de type Kazal et de type Kunitz, mais ceux-ci sont situés sur 2 chaînes peptidiques.
L'inhibiteur de Melithaea caledonica est le premier exemple associant dans une seule protéine des domaines de type Kazal et Kunitz. |
Mécanismes de l'inhibition
L'interaction protéase-inhibiteur peut être schématisée par : |
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Les cinétiques d'inhibition de protéases à sérine par McaPI ont été étudiées selon la méthode de Cha [5]. Les courbes d'inhibition biphasiques (fixation lente) suivent l'équation de Morrisson [6] :
[P] = vs .t + (v0 vs ).(1- e - k t )/ k
avec [P] : concentration du produit formé, v0 : vitesse initiale, vs : vitesse à l'état stationnaire, k : constante de vitesse apparente d'ordre 1.
- Les paramètres cinétiques ( k , v0 , vS ) sont déterminés à l'aide du programme Enzfitter.
- La constante d'association Kass est calculée à l'aide de la formule k = Kdiss + Kass .[I] / 1+[S]/ Km et du graphe k = f ([I]). La constante de dissociation Kdiss est obtenue suivant la formule Kdiss = k . vS /v0.
- La nature compétitive de l'inhibition est démontrée par la linéarité des courbes 1/vs = f (1/[S]) avec différentes concentrations en inhibiteur.
- Lorsque la réaction est irréversible, [P] = (v0 / k ).(1- e - k t ), la constante Kass est alors déterminée selon Bieth [7] à l'aide de la courbe k = f ([I]).
- La stchiométrie de l'interaction inhibiteur-protéase est déterminée par mesure de l'activité résiduelle après incubation de la protéase et de quantités variables d'inhibiteur.
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Cinétiques d'inhibition |
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Stoechiométrie |
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Constantes cinétiques d'interaction de McaPI avec différentes protéases à sérine |
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Spécificité de substrat des différents domaines |
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Conclusions
- L'inhibiteur McaPI isolé chez Melithaea caledonica possède une structure très originale, associant trois domaines de type Kazal "non classique" avec un domaine de type Kunitz en position C-terminale.
- La protéine forme mole à mole un complexe réversible avec l'élastase leucocytaire humaine, l'élastase pancréatique porcine et la kallikréine, et irréversible avec la trypsine et la subtilisine. Par contre deux domaines forment un complexe réversible avec la chymotrypsine.
- McaPI inhibe de nombreuses protéases à sérine par des mécanismes variés.
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Perspectives
Les 3 domaines de type Kazal proviennent-ils de la duplication d'un gène ancestral ?
Détermination de la séquence de l'ADN génomique.
Les 4 domaines sont-ils fonctionnels et quelle est leur spécificité ?
A partir de l'ARNm, clonage de chaque domaine individuellement et expression des domaines recombinants ou synthèse de 4 gènes artificiels.
L'inhibiteur peut-il fixer simultanément plusieurs protéases différentes ?
Liaison d'une première protéase, purification du complexe puis essai de fixation d'une autre protéase.
- Quelle est la structure tridimensionnelle de l'inhibiteur ?
- Quel est le rôle d'un tel inhibiteur chez Melithaea ?
- Recherche d'inhibiteurs naturels d'élastase leucocytaire humaine de plus petite taille.
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Références
1 M. Grassshoff, Senkenbergiana Biol. 1999, 78 , 1-121.
2 M. Grasshoff, G. Bargibant, Les gorgones des récifs coralliens de Nouvelle-Calédonie, Editions de l'IRD, Paris, 2001.
3 S. La Barre, A. Longeon, M. Barthélémy, M. Guyot, J.P. Le Caer, G. Bargibant, C. R. Acad. Paris / Life Sci. , 1996, 319 , 365-370.
4 J.Y. Chang, D. Brauer, B. Wittmann-Liebold, FEBS Lett. , 1978, 93 , 205-214.
5 S. Cha, Biochem. Pharmacol., 1975, 24 , 2177-2185.
6 J.F. Morrisson, Trends Biochem. , 1982, 7 , 102-105.
7 J.G. Bieth, Methods Enzymol ., 1995, 248 , 59-84. |
Remerciements
Les auteurs remercient Pr Manfred GRASSHOFF (Université de Francfort sur Main) et M. Georges BARGIBANT (I.R.D.) pour les prises de vue. |
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